قسمتی از متن پایان نامه مبارزه ی بیولوژیک با نماتد Meloidogyne توسط باکتری Pasteuria penetrans
مقدمه :
امروزه استفاده از مبارزه بیولوژیک در راستای جلوگیری از خسارت آفات و بیماریها به طور گسترده در حال بررسی است و محققین سعی در گسترش روشهای مورد استفاده در مبارزه بیولوژیک دارند.
در این میان نماتدها جزء گروههایی هستند که می توانند خسارت قابل توجهی به گیاهان وارد کنند که خسارتی که نماتدهای پارازیت گیاهی وارد می کنند به دو صورت است. از طرفی آنها موجب ضعیف شدن گیاه میزبان می شوند و شرایط را برای حمله سایر پارازیتها نظیر قارچها، باکتری ها، … مساعد می کنند و از طرفی نماتدها که اکثراً به ریشه گیاه حمله می کنند موجب کاهش رشد زایشی گیاه می شوند.
تاکنون در جهان برای مبارزه با نماتدها بیشتر از نماتد کشهای شیمیایی استفاده می شد ولی اخیراً بدلیل آلودگی های زیست محیطی ناشی از استفاده از نماتدکشها ، در بسیاری از کشورها، استفاده از آنها ممنوع شده است و سعی می شود که با استفاده از روشهای دیگر با نماتدها مبارزه کرد. این در حالی است که زارعین استفاده از نماتد کشهای شیمیایی را ترجیح می دهند،زیرا هم به قدرت تأثیر آن اعتقاد دارند و از طرفی هزینه استفاده از نماتدکشهای شیمیایی با هزینه روشهای بیولوژیک برابری می کند.
از جمله روشهای بیولوژیک موثر در کنترل نماتدها، خصوصاً نماتد مولد غده ریشه Melodogyne sp ، استفاده از باکتری Pasteuria penetrans می باشد که تحقیقات گسترده ای برای عملی کردن استفاده از این باکتری در حال بررسی است، زیرا قدرت بسیار خوبی را در کنترل نماتد نشان میدهد و این باکتری سیستم تولید مثلی نماتد را هدف قرار داده و از ایجاد تخم جلوگیری می کند، لذا دارای پتانسیل بسیار بالایی در کنترل نماتد مولد غده ریشه است.
البته باکتری Pasteuria penetrans یک پارازیت اجباری است و همین امر موجب اعمال محدودیتهای در رابطه با استفاده وسیع از این باکتری شده است، زیرا پاراززیت اجباری بودن، کشف آزمایشگاهی (in vitro) این باکتری را محدود کرده است و دانشمندان سعی در ایجاد محیط کشف مناسب برای تولید آزمایشگاهی این باکتری هستند و در صورت تحقق چنین موضوعی می توان خسارت ناشی از نماتد مولد غده ریشه را تا حد زیادی کاهش داد.
مقدمه
نماتدها — 3
نماتدهای انگل گیاهی — 8
فرآیند بیماری زایی نماتدها — 13
راههای مبارزه با نماتد مولد غده ریشه — 19
مبارزه بیولوژیک با نماتدها. 28
باکتری Pasteuria penetrans
صفات مبارزه ی بیولوژیک — 44
سیستماتیک Pasteuria penetrans
اکولوژی Pasteuria penetrans
دشمنان طبیعی اندسپورها — 60
بیولوژی Pasteuria penetrans
مرحله اتصال — 63
نفوذ — 66
سیکل زندگی در بدن نماتد — 67
اسپورزایی — 70
عوامل موثر برچسبیدن باکتری Pasteuria penetrans به نماتد Meloidogyne spp
اثر تراکم اندوسپورهای P. penetrans در خاک روی چسبیدن
اثر بافت خاک روی چسبیدن اندواسپورها — 79
تأثیر رطوبت خاک روی چسبیدن اندوسپورها — 82
اثر دمای خاک روی چسبیدن اندواسپورها — 85
اثر سن نماتد روی چسبیدن اندواسپور — 87
اثر PH روی چسبیدن اندوسپورها — 90
تفاوت عملکرد ایزوله های مختلف Pasteuria penetrans
تأثیر دمای ثابت و متغیر در گسترش Pasteuria penetrans در بدن نماتد Meloidogyne spp
کشت Pasteuria penetrans
کشت in-vitro
کشت in-vivo
تهیه ی پودر ریشه ی پاستوریا — 108
پودر دتابل پاستوریا (P.W.P). 111
مقایسه ی اثر کنترل بیولوژیک اندوسپورهای in-vivo و in-vito
علل عدم استفاده ی وسیع از Pasteuria penetrans به عنوان یک عامل کنترل بیولوژیک — 119
منابع — 121
1. اصول و مبانی نماتدشناسی گیاهی- دکتر مهدی عنصر اصفهانی- مهندس علیرضا احمدی
- Review of pasteuria penetrans. (Journal of nematology 1998)
- Pasteuria species for Nematode control: Current Developments and future prospects- Kelly S. smith, Thomas E. Hewlett, and James H. white, Entomos, Inc., Gainesville, FL.
- Studies on a pusteuria isolate from an entomopathonematode, Steinernema pakistanense.
- ultrastruture, Morphology, and sporogenesis of pasteuria penetrans- 2.x.Chen, D.W.Dickson, L.G.Freitas and J.F preston-1996.
- Influence of Soil Conditions, Spor densities and nematode age on pasteuria penetrans attachment to Meloidgyne incognita- M.Talavera and T.Mizukubo-2003
- Development of pasteuria penetrans in Meloilegyne javanica famales as affected by Constantly high vs fluctuating temperature in an in-vivo system-DARBAN D.A, GOWEN S.R.. PEMBROKE B., MAHARA. N.2005.
- Comparision of the efficacy of pasteuria penetrans endospores produced invivo and invitro for the Control of Meloidogyne arenaria- T.E.Hewlett, K.S.Smith, S.T.Griswold and W.T.Crow.
- Production of the nematode biological Control agent pasteuria spp. The hard way-Thomas Hewlett, Susan Griswold and Kelly smith.
- Biological Control of plant parasitic nematodes and development of bio-nematicides-wang Zhiwei, weng Zhonghe
- Infection of Meloidogyne javanica with pasteuria penetrans- Amer Zareen, M. Javed Zaki, S.Shahid shaukat and S.R. Gowen. 2002.
مراحل تهیه پودر ریشه ی پاستوریا :
الف ) شناخت ایزوله های صحیح باکتری :
برای تولید مقادیر زیاد اسپورهای باکتری، باید تعداد زیادی از نماتدهای ریشه را در اختیار داشته باشیم. از طرف دیگر با توجه به این که ایزوله های مختلف باکتری p.penetrans به طور نسبی دارای میزبان های اختصاصی هستند، باید ایزوله ی صحیح از باکتری که قادر به چسبیدن به نماتد مورد نظر ما باشد، انتخاب شود. اگر ایزوله های بکار رفته بتوانند نماتدهای هدف را پارازیته کنند، آنها را به تولید انبوه می رسانیم.
برای شناخت ایزوله های صحیح باکتری، سوسپانسیونی از اسپورهای باکتری تهیه می شود. همچنین نماتدهای Meloidogyne.ssp از محل آلوده جمع آوری شده و سپس به وسیله ی تکنیکهای سانتریفیوژی، اسپورهای باکتری و نماتدها به هم می چسبند. اگر اسپورها به نماتدها چسبیدند، نماتدهای آلوده روی گیاه گوجه فرنگی یا میزبان مناسب دیگر، قرار داده می شوند. نماتدها را 20 و 45 روز بعد از، ریشه ها جدا می کنند و رشد ریشه و میزبان تولید اسپور توسط باکتری در بدن آنها، تعیین می شود. ایزوله هایی از باکتری که تا 80 در صد به نماتدها چسبیده و اسپور در بدن آن ها تولید کرده اند، برای تولید انبوه انتخاب می شوند.
ب ) تهیه پودر ریشه :
همانطور که اشاره شد، تولید مقادیر بالای اسپورها مستلزم تولید مقادیر بالایی از نماتدهای Meloidogyne.ssp است. برای این کار جمعیت های نماتد ریشه که از محل های آلوده جمع آوری شده اند باید روی گیاهان میزبان مناسب در گلخانه و درون گلدان به کشت انبوه برسند.
10-5 هزار تخم در گلدان های 6 اینچی قرار می گیرند. تخم ها تفریخ شده و لاروهای سن 2 نماتد برای مرحله ی بعدی که مرحله ی چسبیدن اسپورها است، جمع آوری می شوند. از طرف دیگر سوسپانسیونی از اسپورها تهیه می شود و دانستیه ی اسپورها توسط hemacytometer اندازه گیری می شود. در مرحله ی بعد اسپورها با یکسری تکنیک های سانتریفیوژی به نماتدها می چسبند. تقریباً 100 اسپور برای هر نماتد). بعد نماتدها روی گیاهان میزبان مثل گوجه فرنگی (Cv Rutgers) قرار می گیرند. حدود 20-10 هزار نماتد برای هر گلدان استفاده می شود.بعد از 60 روز سیستم های ریشه ای این گیاهان جمع آوری می شوند. در مقابل هوا خشک شده و پودر می گردند.
تعداد اسپورهایی که تولید می شوند، رنج متفاوتی دارند و از حدود 500-10 میلیون برای هر سیستم ریشه ای می توانند باشند. بعد از آن دانستیه ی اسپورها در پودر ریشه (تعداد اسپور در هر گرم پودر) تعیین می شود که برای کاربرد پودر، مورد استفاده قرار می گیرد. (9). پودر ریشه اغلب به صورت پودر و تابل فرموله شده و در اختیار کشاورزان قرار می گیرد.
پودر وتابل پاستوریا (P.W.P)
آزمایشات مختلف در مزارع و گلخانه ها نشان داده است که پراکندگی اسپورها در خاک روی فعالیت کنترل بیولوژیک Pasteuria تأثیر می گذارد. لذا دانشمندان فرمولانسیونهای مختلفی را جهت بهترین کاربرد پودر ریشه امتحان کردند و در نهایت پودر وتابل را انتخاب کردند که بهترین حالت پراکندگی اسپورها را ایجاد می کند. و آن را پودر وتابل پاستوریا (p.w.p) نامیدند. (6)
مزایای پودر وتابل پاستوریا :
- نداشتن اثر سمیت روی دیگر ارگانیسم ها :
طبق آزمایشات سم شناسی که روی پودر و تابل پاستوریا صورت گرفت، این پودر هیچ گونه سمیتی برای میکروارگانیسم ها ، نماتدهای آزاد، حشرات، گیاهان، ماهی ها و پستانداران نداشت. و به عنوان یک ترکیب نماتدکش امن و بی خطر معرفی شده است.
- قدرت پایداری و نگهداری طولانی مدت :
اسپورهای p.penetrans را می توان به مدت 2 سال یا بیشتر در دمای c,4 به صورت سوسپانسیون نگهداری کرد و اگر به صورت پودر و تابل باشند به مدت 2 سال یا بیشتر در دمای اتاق قابلیت نگهداری دارند و در این حالت اداره کردن آنها هم راحت تر است.
- مقاومت به استرس های شیمیایی و طبیعی :
پودر وتابل پاستوریا به تغییرات محیطی مقاوم است. همچنین مقاومت بالایی به نماتد کش های شیمیایی که در مزارع استفاده می شوند، دارد. و در نتیجه می توان آن را به راحتی به همراه نماتد کش ها ی شیمیایی به کار برد. (10)
کاربرد پودر وتابل پاستوریا :
پودر ریشه را می توان به صورت پیش از کاشت یا هنگام کاشت گیاه به کاربرد و مقدار کاربرد بستگی به دانستیه ی اسپورها در پودر ریشه دارد. با توجه به هزینه های بالای تولید، باید این پودر را در محل دقیق آلوده به نماتد کاربرد. (9)
در یک روش دیگر، پودر و تابل را با نصف میزان نماتدکش شیمیایی مخلوط کرده و در مزرعه به کار می برند و سپس با مقدار زیادی آب زمین را آبیاری می کنند. 7 تا 10 روز بعد، زمین برای کاشت گیاه آماده است. (10)
همچنین این پودر را می توان در سطح زمین در عمق 6-3 اینچی، کاملاً در خاک مخلوط کرد.
روشی که در Land pavilion در EPCOT به کار می رود به این صورت است که خاک محل های آلوده به نماتد را حفر کرده و توسط خاک تمیز که با پودر ریشه ی پاستوریا مخلوط شده است، جایگزین می کنند.
از این روش همچنین در فاروها برای برخی محصولاتشان استفاده می کنند. (9)
مقایسه ی اثر کنترل یک اندوسپورهایی که به روش -vivo و in- vitro تهیه شده اند :
همانطور که قبلاً ذکر شد، اندوسپورهای این باکتری را می توان به دو صورت in-vivo و in-vitro به دست آورد. در آزمایشی، تفاوت عملکرد این دو اسپور در کنترل بیولوژیک نماتدآ Meloidogyne.ssp بررسی شده است.
ایزوله های p.penetrans که در این مطالعه استفاده شدند، از نماتدهای Meloidogyne arenaria که از ریشه های گیاه بادام زمینی در یک مزرعه از فلوریدا جمع آوری شده بودند، استخراج شدند. برای تولید اسپورها به روش in-vivo نماتدهای M.arenaria و باکتری p.penetrans در گلخانه روی گوجه فرنگی (CV Rutgers) کشت داده شدند. بعد از 60 روز، ریشه های گوجه فرنگی جمع آوری شد و سوسپانسیون هایی از اسپور باکتری تهیه شد.
اسپورهای شرایط آزمایشگاهی (in-vitro) از چندین محیط کشت که اسپورهای بالغ تولید کرده بودند، جدا شدند .محیط های کشت محتوی اسپور از ظرف ها شسته شده، سانتریفیوژ شدند.
پوشش های خارجی هر دو نوع اسپورها توسط به کارگیری امواج صوتی (به مدت 3 دقیقه) از بین برده شد تا چسبندگی آن ها افزایش یابد.بعد از آن غلظت اسپور ها برای هر دو حالت in-vivo و in-vitro با استفاده از hemacytometer تعیین شد.
این آزمایش در فلوریدا صورت گرفت. تیمارهای این آزمایش به صورت یک شاهد (کنترل) شامل گیاهان سالم و بدون حضور نماتدها یا اسپورها، یک شاهد (کنترل) شامل گیاهان، نماتدها، اما بدون حضور اسپورهای باکتری، یک تیمار شامل گیاهان، نماتدها و اسپورهای in- vitro و یک تیمار شامل گیاهان نماتدها و اسپورهای in-vivo ، بود. این آزمایش در 5 تکرار انجام شد. خاک استفاده شده در این آزمایش 95 در صد ماسه،5/2 درصد سیلیت و 5/2 در صد رس داشت. اندوسپورها با غلظت 105 اندو سپور در هر cc از خاک، به خاک اضافه شدند .cc25 از خاک هایی که با اندوسپورهای in-vivo یا in-vitro آلوده شده بودند، در لوله های ml50 قرار گرفتند. لاروهای سن 2 نماتد M.arenaria که از گلخانه جمع آوری شده بودند، در هر کدام از لوله ها قرار گرفتند، به میزان 500 لارو برای هر لوله . نشاءهای گوجه فرنگی (4-3 هفته ای) به داخل هر لوله منتقل شدند – لوله ها درانکوباتور در دمای c,30 قرار گرفتند. بعد از 24 ساعت سیستم های ریشه ای گیاهان شسته شد و تعداد گال های نماتد، توده های تخم، تعداد تخم های هر سیستم ریشه ای و در صد نماتدهایی که به وسیله ی باکتری آلوده شده بودند، تعیین شد.
نتایج :
با توجه به جدول شماره 1، تفاوت معناداری در درصد آلودگی نماتدها توسط اسپورهای in-vivo و in-vitro وجود ندارد. و این اسپورها در چسبندگی و آلوده سازی نماتدها شبیه به هم هستند. همچنین تفاوت معناداری در گال های تولید شده، توده های تخم و تعداد تخم های هر سیستم ریشه ای بین تیمارهایی که در آن ها از اسپورهای in-vivo استفاده شده بود با تیمارهایی که در آن ها از اسپورهای in- vitro استفاده شده بود، وجود ندارد. (8)
علل عدم استفاده ی وسیع از p.penetrans به عنوان یک عامل کنترل بیولوژیک :
با توجه به این که بیش از 50 سال است دانشمندان به اثر مفید p.penetrans در کنترل بیولوژیک نماتدها پی برده اند و تحقیقات انجام شده، این باکتری را به عنوان یک عامل کنترل بیولوژیک امید بخش برای نماتدهای Meloidogyne.ssp مطرح کردند، اما هنوز استفاده ی وسیع از این باکتری صورت نمی گیرد. و از این باکتری به طور محدودی در برخی کشت های گلخانه ای استفاده می شود. (9)
علل اصلی این امر، فقدان تکنولوژی لازم برای تولید انبوه p.penetrans است (2)همانطور که قبلاً ذکر شد، این باکتری یک پارازیت اجباری است و هنوز موفق به کشت آن به روش in-vitro در سطح وسیع نشده اند هزینه های کشت این باکتری به روش in-vivo و تهیه پودر ریشه ی باکتری هم بسیار بالا است (8)و با هزینه ی استفاده از نماتد کش های شیمیایی برابری می کند. همچنین سرمایه گذاری و علاقه لازم برای توسعه ی این باکتری به صورت in-vitro و روی محیط کشت اجازه تولید انبوه اسپورها را تحت هزینه های مناسب اقتصادی فراهم می کند. (8) و در این صورت است که می توان از این باکتری در سطوح وسیع در مزارع و باغات برای مبارزه با نماتدها استفاده کرد.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.