قسمتی از متن ترجمه مقاله جداسازی پپتید نگهدارنده مواد غذایی از خربزه تلخ (Momordica charantia L.) و توصیف ویژگی‌های آن
چکیده
به منظور نگهداری مواد غذایی و فاسد نشدن آنها توسط میکروارگانیسم‌ها، از عوامل ضدمیکروبی (AMAs) که به عنوان مواد نگهدارنده نیز شناخته می‌شوند استفاده می‌گردد. این مواد نگهدارنده، از گیاهان بدست می‌آیند یا بصورت شیمیایی سنتز می‌گردند و اکثراً جزء عوامل ضدمیکروبی غیرپروتئینی هستند. در این بین، به عوامل ضدمیکروبی پروتئینی به عنوان ماده نگهدارنده مواد غذایی، توجه کمتری شده است. بنابراین، بررسی عوامل پروتئینی که می‌توانند فعالیت ضدمیکروبی داشته باشند و جایگزین مواد نگهدارنده مصنوعی فعلی شوند ضروری می‌باشد. لذا، این پژوهش اساساً به منظور جداسازی پپتیدهای دارای فعالیت ضدباکتریایی از قسمت‌هایی مختلف خربزه تلخ (Momordica charantia L.) و توصیف ویژگی‌های آنان انجام شده است. عصاره خام بذرها، مغز ساقه و پوست گیاه با نمک بافر فسفات (PBS) آماده شدند و فعالیت ضدباکتریایی آنها در محیط کشت لوریا برتانی براث آگار (LB) بر روی سویه‌هایی از قبیل اشرشیا کلای (Escherichia coli)، استافیلوکوکوس اروئوس (Staphylococcus aureus)، سالمونلا تیفی (Salmonella typhi)، و سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) بررسی شد. از آنجاییکه فعالیت ضدمیکروبی فقط در عصاره بذرها مشاهده شد بنابراین، پپتید/پپتیدهای موجود در عصاره بذر با محلول سولفات آمونیوم 75٪ رسوب داده شدند؛ و برای خالصسازی آنها از روش کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی (GFC) و ستون Sephadex G-100 استفاده گردید. فعالیت ضدمیکروبی پپتیدهای موجود در رسوبات حلشده در سولفات آمونیوم و جزءهای پیک در کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی (1-4) نیز بررسی شدند. علاوه بر این، با استفاده از الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلیآکریل آمید (SDS-PAGE) همگنی و جرم مولکولی پپتیدهای موجود در جزءهای ادغامشده کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی، عصاره خام سلولی، و رسوبات حلشده در سولفات آمونیوم، تعیین گردید. در پیک 3 کروماتوگرافی، یک پپتید با جرم مولکولی 10 کیلودالتون و دارای فعالیت ضدمیکروبی به دست آمد. این پپتید خالص در محدوده دمایی50-4 درجه سانتیگراد پایدار بود؛ محدوده فعالیت آن بین pH5-7 قرار داشت؛ و توسط تریپسین و پروتئیناز K، غیرفعال می‌شد. براساس مقادیر حداقل غلظت مهاری (MIC) این پپتید خالص، مشخص شد که استافیلوکوکوس اورئوس حساس‌ترین سویه نسبت به این پپتید است. مشخص شد که در P <0.001 و غلظت 40 میکروگرم از این پپتید، تعداد کلنی‌های استافیلوکوکوس اورئوس موجود در گوشت چرخکرده به میزان معناداری از0/8 تا 77/3 log CFU کاهش یافتند. نتایج پژوهش ما نشان می‌دهد که پپتید ضدباکتریایی بدست آمده از بذرهای گیاه خربزه تلخ می‌تواند به عنوان یک نگهدارنده طبیعی و بیولوژیکی برای گوشت چرخکرده، مورد استفاده قرار گیرد. با این حال، تأثیر این پپتید بر میکروارگانیسم‌های دیگر، خصوصیات آن و سمی بودن یا نبودن آن، نیازمند انجام مطالعات بیشتر می‌باشد.
کلمات کلیدی:
Momordica charantia (خربزه تلخ)؛ عامل ضدمیکروبی؛ مواد نگهدارنده؛ پپتیدها؛ باکتریها.
Abstract
Antimicrobial agents (AMAs) also known as preservatives are being used to keep food safe and unspoiled from microorganism. These preservatives, derived from plant sources or synthesized chemically are mostly non-proteinaceous AMAs. Less attention has been given to proteinaceous AMAs which may be used as preservative in food. Thus, there is a need to explore proteinaceous AMAs having antimicrobial activity with potentials to be used as an alternative to the presently used preservatives which are mostly synthetic. Therefore, the present study was carried out systematically to isolate and characterize peptides having antibacterial activity from different parts of bitter melon (Momordica charantia L.). Crude aqueous extracts of seeds, pulp and skin were prepared in phosphate buffer saline (PBS) and antibacterial activity was checked on Luria Bertani (LB) broth agar plates against a number of bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi and Pseudomonas aeruginosa. Since antimicrobial activity was observed only in seeds therefore, seed extract was used for peptide(s) precipitation with 75% ammonium sulfate solution and purification by gel filtration chromatography (GFC) using Sephadex G-100. Antimicrobial activity was also checked in dissolved ammonium sulfate precipitate and GFC peak fractions (1–4). Further, homogeneity and molecular mass of GFC pooled fractions along with crude extract and dissolved ammonium sulfate precipitate were determined by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). One peptide with molecular mass ∼10 kDa with antimicrobial activity was obtained from peak 3. The purified peptide was stable at 4–50 °C, active between 5–7 pH and inactivated by trypsin and proteinase K. Based on minimum inhibition concentration (MIC) values of purified peptide S. aureus was found to be the most sensitive strain. The use of this strain with minced meat showed significant viable count decreased i.e. from 8.0 to 3.77 log CFU with P < 0.001 at concentration of 40 μg peptide. The results of our study suggest that antibacterial peptide obtained from seeds of M. charantia L. may be used as an alternative natural biopreservative source for minced meat products. However, further studies need to be carried out to check the effect of this peptide on more microorganisms, characterization and its toxicological analysis.
Keywords
Momordica charantia, Antimicrobial agent, Preservatives, Peptides, Bacteria
- چکیده
- 1. مقدمه
- 2. مواد و روش‌ها
- 2.1. مجموعه گیاهان و میکروارگانیسم‌ها
- 2.2. استخراج پروتئین و خالص سازی جزئی
- 2.3. کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی و الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات -پلی آکریل آمید (SDS-PAGE)
- 2.4. سنجش فعالیت ضدمیکروبی
- 2.4.1. کشت ثانویه (زیرکشت/ کشت فرعی) سویه‌های باکتری
- 2.4.2. روش انتشار دیسک
- 2.4.3. حداقل غلظت بازدارنده در محیط‌های کشت
- 2.4.4. آنالیز آماری
- 2.5. اثر درجه حرارت‌های مختلف، pHهای متفاوت و آنزیم‌های پروتئولیتیک متنوع
- 2.6. اثر پپتید خالص بر روی گوشت چرخ کرده تلقیح شده با استافیلوکوکوس اورئوس
- 3. نتایج و بحث
- 3.1. فعالیت ضدمیکروبی
- 3.2. پروفایل کروماتوگرافی رسوب دیالیزی حل شده در سولفات آمونیوم که از بذرها بدست آمده اند
- 3.3. SDS-PAGE
- 3.4. اثر درجه حرارت‌های مختلف، pHهای متفاوت و آنزیم‌های متنوع بر فعالیت ضدمیکروبی پپتید خالص
- 3.5. اثر پپتید خالص بر تکثیر ظاهری باکتریها
- 3.6. تأثیر پپتید خالص بر تشکیل کلنی‌های زیست پذیر (قابل دوام/زنده ماندنی) استافیلوکوکوس اورئوس
- 4. نتیجه گیری
- منابع
- Abstract
- Keywords
- 1. Introduction
- 2. Materials and methods
- 2.1. Collection of plant and microorganisms
- 2.2. Protein extraction and partial purification
- 2.3. Gel filtration chromatography and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE)
- 2.4. Antimicrobial assay
- 2.4.1. Sub-culturing of bacterial strains
- 2.4.2. Disc diffusion method
- 2.4.3. Minimum inhibitory concentration in culture media
- 2.4.4. Statistical analysis
- 2.5. Effect of various temperatures, pH and proteolytic enzymes
- 2.6. Effect of purified peptide on minced meat inoculated with S. aureus
- 3. Results and discussion
- 3.1. Antimicrobial activity
- 3.2. Chromatographic profile of dissolved and dialyzed ammonium sulfate precipitates of seeds
- 3.3. SDS–PAGE
- 3.4. Effect of various temperatures, pH and enzymes on antimicrobial activity of purified peptide
- 3.5. Effect of purified peptide on apparent proliferation of bacteria
- 3.6. Effect of purified peptide on viable count formation of S. aureus
- 4. Conclusion
- References
مقدمه
از زمان‌های قدیم، رستنی‌ها و گیاهان دارویی زیادی برای مقابله با عفونت باکتریایی در طب سنتی استفاده می‌شده است (کوک و همکاران، 2000؛ مارتین و ارنست، 2003؛ اوکولی و ایروگبو، 2004). استفاده از عصاره گیاهان رویشی و دارویی به عنوان عامل ضدمیکروبی در غذاها و نوشیدنی‌های گوارا نيز برای قرن‌ها گزارش شده است (فریدمن و همکاران، 2002؛ گلومز و همكاران، 2006). به دلیل سمیت بالقوه مواد نگهدارنده شیمیایی، تقاضا برای استفاده از مواد نگهدارنده طبیعی، افزایش یافته است. به همین دلیل، محققان و دستاندرکاران مواد غذایی به افزودنی‌های غذایی طبیعی با فعالیت‌های ضد میکروبی وسیع، دست یافتهاند. در نتیجه، امروزه محصولات ضدمیکروبی گیاهی، برای ممانعت از رشد باکتریها و قارچ‌ها در سیستم غذایی از اهمیت بالایی برخوردار هستند (سوزا و همکاران، 2005 الف و ب). تمایل مشتری به مصرف محصولات غذایی دارای عناصر سازنده طبیعی، در حال افزایش می‌باشد. مطالعات متعددی استفاده افراد از مولکول‌های طبیعی مانند اسیدهای آلی، پپتیدها و روغنهای ضروری در چند سال گذشته را گزارش داده‌اند (بارتیو و همکاران، 2004).
مواد ضدمیکروبی که به عنوان ماده نگهدارنده مورد استفاده قرار می‌گیرند، ترکیبات شیمیایی هستند که با مهار رشد میکروارگانیسم‌های بیماریزا و افزایش ماندگاری مواد غذایی جلوی فاسد شدن آنها را می‌گیرند. می‌توان از ترکیبات ضدمیکروبی طبیعی که از حیوانات، گیاهان و میکروبها جداسازی شده‌اند به تنهایی یا بصورت ترکیب با سایر مواد نگهدارنده ضدمیکروبی مجاز، استفاده کرد (دیویدسون، 2006). با این حال، مطالعات صورت گرفته توسط اکینپلو (2001) و سوزا و همکاران (2005a ، b) خاطرنشان کردند که میکروارگانیسم‌های مقاوم به دلیل استفاده گسترده و تصادفی(نسنجیده) از نگهدارنده های شیمیایی ظاهر می‌شوند و این امر می‌تواند منجر به افزایش بروز بیماری‌های ناشی از مواد غذایی گردد.
علاوه بر ترکیبات شیمیایی، پپتیدهای ضدمیکروبی (AMP) نیز معمولاً در همه اشکال حیات در طبیعت، وجود دارند و نقش مهمی در سیستم دفاع غیراختصاصی میزبان ایفا می‌کنند. در ابتدا، این پپتیدها از پوست قورباغه و غدد لنفاوی حشرات برای کشتن باکتریها در محیط آزمایشگاهی، استخراج شدند. امروزه بیش از 800 نوع پپتید ضدمیکروبی در بسیاری از موجودات زنده از جمله حشرات، گیاهان، دوزیستان و پستانداران توصیف شده است (ریدلو و همکاران، 2006). برخی پروتئین‌های گیاهی، دارای فعالیت ضدمیکروبی در برابر باکتریها و قارچ‌ها هستند؛ و معمولاً نقشی اساسی در سیستم دفاعی گیاه و محافظت از گیاه میزبان در برابر فیتوپاتوژنها برعهده دارند. این پروتئین‌ها براساس عملکردها و شباهت‌های ساختاری خود به گروه‌ها و خانواده‌هایی طبقه بندی شده‌اند. پروتئین‌های اصلی و مهم شامل سیکلوتیدها، دفنسین ها، پروتئین‌های انتقالدهنده چربی (LPTs)، لکتین ها، پروتئین‌های مرتبط با آسیبزایی، پروتئین‌های اتصالدهنده کیتین، پروتئین‌های غیرفعالکننده ریبوزوم، و مهارکننده‌های آنزیم‌های هضمی/گوارشی هستند (پلگرینی و همکاران، 2008).
Momordica charantia L. غالباً تحت عنوان خربزه تلخ شناخته می‌شود؛ این گیاه عضو خانواده Cucurbitaceae و یک گیاه گرمسیری است که امروزه در سراسر جهان پراکنده شده است و خواص درمانی همچون ضد دیابت، آنتی اکسیدان، ضد ویروس و فعالیت‌های آنتینئوپلاستیک دارد (گوور و یاداو، 2004؛ بلوین و همکاران، 2005؛ سمیز و سن، 2007؛ پول و رایکودهاری، 2010). اگرچه پیشنهاد شده است که قسمتهای مختلف خربزه تلخ دارای خواص درمانی هستند اما پلیپپتید (پلیپپتید p) جداسازیشده از بذرهای این گیاه به دلیل فعالیت کاهندگی قندخون (کاهشدهنده قندخون)، بیشتر مورد توجه قرار گرفته است (خانا و همکاران، 1981). در پژوهشهای آزمایشگاهی و پژوهشهای صورتگرفته در داخل بدن موجود زنده مشخص شده است که MAP30 نوترکیب و بخشهای پروتئولیتیک آن (MAP30: پروتئین دیگر جداسازی شده از خربزه تلخ) دارای فعالیت‌های ضد ویروسی، ضد HIV (ضد ایدز) و ضدسرطان هستند (لی-هونگ و همکاران، 1990، 1995 الف، ب؛ هوانگ و همکاران، 1999؛ بأس و همکاران، 2003). به نظر می‌رسد که عصاره‌های بدست آمده از خربزه تلخ نیز رشد بسیاری از باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت از قبیل اشرشیا کلای، سالمونلا تیفی، شیگلا دیسانتری، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا، استرپتوباسیلوس مونیلیفورمیس، استرپتوکوکوس پنومونیه، و هلیکوباکتر پیلوری، و ارگانیسم‌های انگلی مانند انتوموبا هیستولیتیکا و پلاسمودیوم فالسیپاروم را مهار می‌کند (ناشناس، 2007). بصورت طبیعی، مهارکننده‌های میکروبی در بسیاری از مواد غذایی از جمله پیاز، سیر، میوه‌ها، سبزیجات، غلات و ادویهجات وجود دارند. بسیاری از این ترکیبات ضدمیکروبی موجب مقاومت طبیعی مواد غذایی در برابر فرسودگی می‌شوند (کیوانچ و کوندوهوگلو، 1997). به نظر می‌رسد تمایل مجدد افراد به محافظت خود در برابر بیماریها با استفاده از مواد طبیعی، نگرانی‌های تازهای درباره ایمنی مواد غذایی و مشکلات رو بهرشدی درباره مقاومت میکروبی بوجود می‌آورد؛ و تولید محصولات غذایی با کمترین میزان فرآوری در راستای سیاستهای درست صنایع غذایی را افزایش می‌دهد (سوهر و نیلسون، 2003). با توجه به اهمیت پپتیدهای ضدمیکروبی که از مواد طبیعی و ارگانیک بدست می‌آیند، این پژوهش به منظور جداسازی، توصیف، و تعیین پتانسیل پپتیدهایی که دارای فعالیت ضدباکتریایی بر علیه پاتوژن های مواد غذایی معمولی هستند و از قسمتهای مختلف M. charantia L. بدست آمدهاند طراحی شده است.
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.